重磅
奥浦迈培养基
助力武大团队Nature发文
优化，成就与众不同
每一项科研成果都离不开高质量科研试剂的支撑。作为全球领先的细胞培养基供应商，奥浦迈始终致力于为科研院所和广大药企提供高性能的细胞培养基产品，成功助力多项科学研究和药物开发及生产。近日，奥浦迈自主研发的HEK293细胞无血清培养基OPM-293 CD03再次不负众望，助力武汉大学生命科学学院严欢课题组获得重大发现——MERS相关冠状病毒使用ACE2而非DPP4进入细胞，突破了目前人们对冠状病毒受体的传统认知，这一重大发现也被报道在《Nature》上。（点击文末阅读原文即可查看文章）
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01
研究背景
# BACKGROUND #
冠状病毒是一大类有包膜的正链 RNA 病毒，分为四个属：α-、β-、γ-和δ冠状病毒。α和β冠状病毒通常感染哺乳动物，例如蝙蝠和人类，而γ-和δ冠状病毒主要感染鸟类，偶尔也会感染哺乳动物。冠状病毒的跨物种传播在过去20年中导致了SARS-CoV、MERS-CoV 和SARS-CoV-2 9-12 分别引起非典、中东呼吸综合征以及新冠疫情的爆发。
MERS-CoV属于β冠状病毒（merbecovirus 亚属）的C系，是目前已知致病力最强的人类冠状病毒，具有大约 35%的高病死率。MERS-CoV功能受体是二肽基肽酶4（DPP4），具有感染多种人类细胞系的能力。
MERS-CoV的两种近亲病毒NeoCoV（在全基因组水平上具有 85%的核苷酸序列同一性）和PDF-218（在系统发育上与 NeoCoV 密切相关，在S 1亚基中约有 91%的氨基酸序列同一性）分别于2012年与2017年在南非与乌干达的蝙蝠样本中被发现，但关于其作用受体尚无明确报道。病毒作用受体往往决定了其宿主范围，组织嗜性与传播能力，因此，成功鉴定受体对于评估病毒传播规律、开发疫苗与药物具有重要意义。
02
研究概述
# SUMMARY #
作者首先使用假病毒系统测试了人类 DPP4 (hDPP4)是否可以多种 merbecoviruses 进入细胞进入，结果显示，MERS-CoV S 和 HKU4 S 假型病毒在 BHK-21-hDPP4 和 HEK293T-hDPP4 细胞中表现出稳健的进入，同时意外发现NeoCoV S 和 PDF-2180 S 两种假型病毒进入表达 hACE2 的细胞显着增加，但在表达 hAPN 的细胞中没有。作者进一步测试了46种蝙蝠ACE2受体，发现NeoCoV S 和 PDF-2180 S可以有效进入大多数阳翅目蝙蝠表达 ACE2 的细胞（图1），而使用来自阴翅目蝙蝠或人类的表达 ACE2 的细胞则没有或非常有限地观察到进入。作者排除了蝙蝠 DPP4 作为 NeoCoV 或 PDF-2180 的可能受体，因为经过测试的 DPP4 直系同源物均不能促进这两种假型病毒的可检测进入。目前研究人员普遍认为MERS-CoV主要以DPP4为受体，严欢课题组的这一发现突破了目前人们对冠状病毒受体的传统认知。
图1 NeoCoV (a) PDF-2180 (b)假型病毒的进入效率
为了确定ACE2识别机制，作者对 Bat37ACE2 在与NeoCoV 和 PDF-2180 RBD 的复合物进行了结构研究（图2）。NeoCoV RBD-Bat37ACE2 复合体主要采用二聚体状态，两个 ACE2 拷贝与两个 RBD 结合，而在PDF-2180-Bat37ACE2 复合体中仅观察到单体状态。NeoCoV和 PDF-2180以非常相似的方式即一种依赖于蛋白-糖基相互作用的全新结合模式识别 Bat37ACE2。
图2 NeoCoV RBD 和 PDF-2180 RBD在Bat37ACE2复合体中的冷冻电镜结构
为了评估NeoCoV和PDF-2180适应hACE2的风险，作者同时探索了hACE2和Bat37ACE与NeoCoV和PDF-2180 RBD结合能力，通过生物层干涉测量法(BLI)发现NeoCoV和 PDF-2180 RBD 以最高的亲合力结合Bat37ACE，而 hACE2 结合较弱。ELISA也证明了NeoCoV 和 PDF-2180 RBD 与 Bat37ACE2 之间的强结合，但不是 hACE2。
为了寻找NeoCoV 和 PDF-2180 RBD 无法与 hACE2 有效结合的原因，作者首先检查了限制 hACE2 支持这两种假型病毒进入的分子决定因素。通过比较其他三种使用 hACE2 的冠状病毒的结合界面，作者发现 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和 NL63 RBD 在 hACE2 上共享重叠足迹，与 NeoCoV 接触的区域几乎没有重叠。基于 hACE2 和 Bat37ACE2 的序列比对和结构分析，作者预测低效的 hACE2 结合可能归因于与 NeoCoV 和 PDF-2180 结合界面处的次优残基，尤其是在 337-342 附近的不同残基周围。为了验证这一假设，作者将这些 hACE2残基替换为来自 Bat37ACE2 直系同源物的残基，与野生型 hACE2 相比，这些突变导致与 RBD 的结合亲和力显着增加，并且NeoCoV和PDF-2180 S假型病毒的进入效率分别提高了大约 15 倍和 30 倍（图3）。
图3 野生型 hACE2 相比于突变型hACE2，NeoCoV 和 PDF-2180 S 假型病毒的进入效率变化
作者之后探索了相关抗体阻断假病毒进入细胞的能力，评估了这两种β冠状病毒抗体B6和S2P6阻断 PDF-2180和NeoCoV S介导的进入的能力。结果表明B6和 S2P6 以剂量依赖的方式抑制 PDF-2180、NeoCoV 和 NeoCoV-T510F S 假型病毒进入瞬时转染了Bat40ACE2或hACE2的HEK293T 细胞。靶向ACE2的特异性抗体（H11B11）也可以有效地阻断这两种病毒的假病毒进入细胞。
综上所述，作者确定了MERS-CoV 的近亲，如 NeoCoV 和 PDF-2180，与蝙蝠ACE2结合以进入细胞。该研究成果有助于促进针对使用ACE2受体的MERS相关冠状病毒的基础研究，并为相关疫苗与抗病毒药物的研发奠定了基础。需要强调的是，迄今为止，没有证据表明 NeoCoV 或 PDF-2180 可以感染蝙蝠以外的哺乳动物，其致病力与传播能力也有待进一步研究。
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在本篇Nature研究中，OPM-293 CD03被作为HEK Expi 293F细胞的培养基用于表达低温电子显微镜分析的蛋白质。
OPM-293 CD03是化学成分确定（Chemically-defined）的培养基，不含水解物、蛋白、生长因子、L-Glutamine及任何动物来源的成分，广泛应用于各种亚型HEK293细胞的高密度培养及高效率瞬时转染。
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多项临床应用
—写在最后—
历史上几次疫情爆发让人们逐渐意识到，我们无法完全阻止病毒的传播，但我们能做的是通过研究预测出病毒的传播特性及致病力，进而加强对病毒的监测与预防，才能打赢这场没有硝烟的战争。
-联