来源 :南模生物2022-11-03
在临床上，特应性皮炎(AD)和银屑病被认为是互不关联的两种慢性炎症性皮肤疾病。其中AD是由2型T辅助细胞(TH2细胞)驱动，与白细胞介素-4 (IL-4)和IL-13过量产生有关，而银屑病主要由TH17细胞驱动，与IL-17激活有关。尽管角质形成细胞对T细胞来源的细胞因子的异常应答是AD和银屑病病理的固有特征，但这两种皮肤疾病是否具有调节角质形成细胞炎症应答的共同机制尚不清楚。
2022年10月21日，华东师范大学赖玉平教授团队在Nature Immunology发表了题为IL-17D-induced inhibition of DDX5 expression in keratinocytes amplifies IL-36R-mediated skin inflammation的研究成果。该研究发现RNA解旋酶DDX5结合剪接因子SF2调节角质形成细胞中IL-36R的剪接生成IL-36R和sIL-36R，而AD和银屑病皮损中的细胞因子IL-17D激活CD93-p38 MAPK-AKT-SMAD2/3信号通路抑制角质形成细胞中的DDX5来促进IL-36R的产生，但抑制sIL-36R的表达。在小鼠角质形成细胞中特异敲除Ddx5 (Ddx5?KC)使得小鼠更易得AD和银屑病，而给Ddx5?KC AD或银屑病小鼠注射sIL-36R或在角质形成细胞中回补sIL-36R均能抑制皮肤炎症，减轻疾病症状。
南模生物为该研究定制了DDX5-flox, sIL36R-flox条件性敲除小鼠和K14-Cre工具鼠。
为了证明DDX5在皮肤炎症中的作用，研究人员首先分析了GEO数据库中健康对照者、AD和银屑病患者皮肤的RNA-Seq和单细胞测序（scRNA-Seq）结果，发现DDX5 mRNA的表达在AD和银屑病患者皮损中显著降低。免疫荧光染色进一步证实DDX5蛋白主要在健康对照者皮肤角质形成细胞中高表达，而在AD和银屑病患者皮损角质形成细胞中的表达显著降低。另外，在OVA或MC903（卡泊三醇）诱导的AD小鼠和咪喹莫特（IMQ）诱导的银屑病小鼠皮损角质形成细胞中DDX5 mRNA和蛋白的表达也被抑制。为了证明DDX5在AD和银屑病中的作用，他们构建了在角质形成细胞中特异敲除Ddx5 (Ddx5?KC)的条件小鼠。与Ddx5fl/fl同窝小鼠相比，Ddx5?KC小鼠对MC903和IMQ更敏感，主要表现在：MC903诱导的Ddx5?KCAD小鼠皮肤上有明显增厚的鳞片和更多的斑块，皮损中与AD致病相关的关键因子Il4、Il13、Ccl11、Ccl17 和 Ccl22的表达显著增加，皮损中浸润的CD45+免疫细胞（包括 CD11b+SiglecF+嗜酸性粒细胞、CD49b+IgE+嗜碱性粒细胞和 CD3+CD4+ T 细胞）增多；IMQ诱导的Ddx5?KC银屑病小鼠皮肤上斑块增多，表皮层棘层增厚，皮损中与银屑病致病相关的关键细胞因子、趋化因子以及免疫细胞的浸润也明显增多，证明角质形成细胞中DDX5的缺失诱发皮肤炎症。
随后，研究人员通过筛选在AD和银屑病中高表达的细胞因子，发现IL-17D是抑制角质形成细胞中DDX5表达的关键细胞因子。它通过激活CD93-p38 MAPK-AKT-SMAD2/3信号通路抑制DDX5的表达。IL-17D及其受体CD93的缺失使得小鼠能抵抗MC903和IMQ诱导的皮肤炎症。
另外，研究人员通过体外细胞实验证明DDX5的缺失能选择性增强角质形成细胞对IL-36的应答。为了寻找DDX5–/–角质形成细胞选择性增强IL-36应答的分子机制，研究人员对WT vs DDX5–/–角质形成细胞、Ddx5fl/fl vs Ddx5?KCAD小鼠皮损和Ddx5fl/fl vs Ddx5?KC银屑病小鼠皮损进行RNA-Seq，综合分析三个RNA-Seq数据后发现DDX5主要调节与白细胞迁移、正向调节细胞因子产生和细胞趋化作用相关的基因的表达，这些均是导致AD和银屑病的关键因素。DDX5的缺失除了上调这些因子的表达，还能上调IL-36R在角质形成细胞、Ddx5?KCAD和银屑病皮损中的表达。并且，在DDX5–/–角质形成细胞中敲低IL-36R能明显抑制DDX5–/–角质形成细胞对IL-36应答，证明DDX5的缺失通过上调IL-36R的表达促进角质形成细胞对IL-36的应答。
接下来，研究人员开始探究DDX5负调控IL-36R信号促进角质形成细胞炎症应答的机制。pre-mRNA剪接是基因表达转录后调控的关键步骤，他们在量化分析RNA-Seq数据中剪接事件的变化时，发现DDX5的缺失改变了多个剪接事件，尤其是可变剪接中的外显子跳跃。因此，他们推测DDX5可能通过调节IL-36R pre-mRNA的可变剪接来调控IL-36R的表达。利用DNA-PAGE检测内源性IL-36R的剪接和IL-36R miniGene报告系统也证实DDX5确实能调节人源IL-36R pre-mRNA的3号外显子跳跃或鼠源IL-36R pre-mRNA的6号外显子跳跃，均使IL-36R pre-mRNA的翻译提前终止，产生含IL-36R胞外段的可溶性蛋白（sIL-36R）。
因DDX5无法直接结合外显子剪接增强子（exonic splicing enhancers, ESEs）来调节IL-36R的剪接，所以研究人员进一步通过免疫沉淀和质谱连用的方法寻找DDX5结合的剪接因子。在鉴定的6个DDX5结合的剪接因子中，只有SF2（也称SRSF1）与IL-36R pre-mRNA的外显子3以及侧翼外显子2和4结合。并且，RNA免疫沉淀实验证明SF2结合侧翼外显子4的能力显著强于与外显子3的结合，导致外显子3的跳跃而生成sIL-36R。当DDX5被敲除后，SF2的表达减少，结合外显子4的能力减弱，从而无法介导外显子3的跳跃而生成IL-36R。
确定DDX5结合SF2协同调节IL-36R剪接产生sIL-36R后，研究人员通过竞争性免疫沉淀和FACS证明sIL-36R与IL-36R竞争结合它们的配体IL-36来抑制IL-36-IL-36R信号通路。在角质形成细胞中表达sIL-36R能抑制角质形成细胞对IL-36的免疫应答，并且，给AD和银屑病小鼠注射重组的sIL-36R能抑制小鼠皮肤炎症。最后，他们证实给Ddx5?KC AD或银屑病小鼠注射sIL-36R或在角质形成细胞中回补sIL-36R均能抑制皮肤炎症，减轻疾病症状，证明AD和银屑病皮损中sIL-36R的减少是Ddx5?KC小鼠皮肤炎症加重的诱因。
综上所述，该研究揭示IL-17D- CD93抑制角质形成细胞中DDX5的表达会加重皮肤炎症，提示IL-17D和DDX5可作为炎症性皮肤病的治疗靶点。另外，sIL-36R的鉴定为RNA剪接异常如何参与皮肤炎症的发生提供了见解，也为AD和银屑病的治疗提供了可选择的药物。
华东师范大学生命科学学院上海市调控生物学重点实验室的倪欣惠、徐艺和王旺博士为本文共同第一作者，赖玉平为通讯作者。