2024年2月28日，BioAge和成都先导联合在线发表了题为《The discovery of novel and potent indazole NLRP3 inhibitors enabled by DNA-encoded library screening》的文章1 。其中描述了一系列具有新颖结构的高效和电中性NLRP3可逆抑制剂的发现，这些抑制剂是通过筛选成都先导早期的DNA编码化合物库（DEL）中的5000亿分子（DEL库分子数量现已突破1.2万亿）获得的。在筛选过程中，采用了多个阳性化合物作为竞争的并行筛选策略。重要的是，先导化合物BAL-0028（化合物3）与以前报告的NLRP3抑制剂相比，在化合物结构、生物物理检测、生物化学活性和理化性质上有显著的差异（图1）。
图1：成都先导DEL筛选直接获得新颖NLRP3可逆抑制剂。A）DEL筛选过程和新颖电中性NLRP3抑制剂结构。B）SPR表征BAL-0028化合物的亲和力。C）DEL筛选化合物BAL-0028具有不同的作用机制（分子对接）。
NLRP3是一种细胞内传感蛋白，能够检测到广泛的危险信号和环境侵害。其激活会导致一种保护性的促炎症反应，通过形成NLRP3炎症体来阻碍病原体和修复组织损伤。NLRP3炎症体的组装导致依赖Caspase 1的促炎症细胞因子IL-1beta和IL-18的分泌释放，以及导致Gasdermin D介导的细胞焦亡。
据报道，许多疾病与NLRP3活化失调有关。多种急性和慢性中枢神经系统（CNS）以及全身性疾病与异常的NLRP3活化有关，包括阿尔茨海默症、帕金森病、II型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、痛风、动脉粥样硬化性纤维化等（图2）2,3。抑制NLRP3的活化将有望提供一种有效的治疗这些疾病的方法和减少相关的临床不良反应。
图2：A）导致神经退行性疾病的常见失调机制。B）炎症体复合体的形成和MCC950的作用机制。
已知的小分子NLRP3抑制剂包含多种结合位点，并有可逆或不可逆两种作用机制。其中，MCC950是临床前药效模型中公认的阳性化合物，虽然该化合物进入了用于治疗类风湿性关节炎的临床试验，但在I/II期临床试验中，由于在日口服1200毫克剂量时显示出肝酶升高，因此已从临床中撤出。尽管MCC950是一种选择性较强的NLRP3抑制剂，具有高血浆蛋白结合力和良好的口服生物利用度，但在CNS相关疾病中渗透能力有限和排泄速度快。
该研究旨在发现具有新颖化学结构、良好优化潜力和CNS渗透性的NLRP3抑制剂，用于治疗神经性疾病。在此基础上，还希望NLRP3小分子化合物为可逆抑制剂，并具有独特的作用机制和理化特性。为了实现这些目标，BioAge决定使用成都先导的DNA编码化合物库（DEL）技术进行该类化合物的开发（DEL筛选已经被证明可以有效地识别出一系列目标的新颖、高亲和力的化合物4）。
DNA编码化合物的筛选由成都先导完成。在筛选实验中，使用了成都先导的DNA编码化合物库（DEL当时包含超过5000亿个化合物），采用了多条件并行筛选的策略，以便提高NLRP3的稳定性、保留ATPase活性，同时使用了几种具有不同结合位点的NLRP3抑制剂作为竞争，便于对筛选结果进行综合分析（筛选策略如表1所示）。
表1：DEL筛选分组策略
通过对筛选结果的分析和对不同条件下富集信号的比较，发现筛选的富集信号在样本2~5中非常相似，这提示新发现的配体与三个NLRP3参考抑制剂的结合方式可能不同。实际上，从筛选中获得的最理想化合物最好为电中性，以便比上述阴离子NLRP3抑制剂MCC950、CY-09和tranilast（图3）的理化性质更具有优势。文章中也描述了相关DNA编码化合物库DEL1149库的合成路线，具体包含521种醛、354种羧酸和528种硼酸酯逐步反应生成的含有9880万种化合物的DEL库，如Scheme 1所示。
图3：代表性的NLRP3抑制剂与化合物结构。
Scheme1：DEL1149库的合成路线。
之后，对筛选中富集的代表性化合物进行不含DNA标签的合成，通过抑制人单核细胞THP-1细胞系中的IL-1beta的分泌来进行活性检测（THP-1细胞在标准的细胞培养条件下表达高水平的NLRP3炎症体，并易形成具有完全活性的NLRP3炎症体复合物）。部分化合物结构与构效关系（SAR）总结在表2中（更多构效关系请参见参考文献1）。
表2：构效关系研究
通过NLRP3NACHT蛋白结构和化合物3的亲和力结合实验（SPR），证实了化合物3和重组NLRP3蛋白之间具有高亲和性（KD：104~123 nM，详见参考文献1）并在THP-1细胞上的化合物洗脱实验中，证实化合物3和MCC950的结合均为可逆（结果与MCC950报道一致，图4）。
图4：化合物3（BAL-0028）可逆地结合NLRP3蛋白。
在文章中，化合物3（BAL-0028）被选定进行扩展研究，以评估化合物的成药性和优化空间。化合物3在人源蛋白结合中显示出0.16%的未结合比，以及在小鼠脑均质物结合中的0.01%的未结合比。化合物3在Caco-2实验中显示出低的转运蛋白介导排出，在人类、大鼠和小鼠微粒体中具有适中的稳定性，以及基于CYP抑制推断的低几率药物-药物相互作用，同时在犬体内清除程度适中（详见参考文献1）。
使用人肝细胞对化合物3（BAL-0028）进行了代谢物产物研究，结果表明，氧化代谢主要发生在吲唑环上，内外芳香环及其取代基是次要代谢位点。为了增加化合物的稳定性，后续设计并合成了几个关键的衍生物，其微粒体稳定性的结果总结在表3中。在吲唑C-4处用氟（化合物21）进行官能团化，得到了与化合物3相似的抑制活性和比化合物3高11倍的代谢稳定性。化合物21在人微粒体中的稳定性增强可能是由于氧化位点屏蔽和降低吲唑环的氧化活性导致的。
表3：构效关系研究
综上所述，BioAge使用成都先导的DNA编码化合物库（DEL）技术，对MBP-NLRP3-HIS蛋白进行超过5000亿种库化合物的筛选，发现了一系列结构新颖、活性高和电中性的可逆NLRP3抑制剂。筛选过程中使用的阳性化合物均具有阴离子特征，其相对一致的非竞争性富集信号促使我们发现了具有新颖结合位点的NLRP3配体。后续对直接在筛选中发现的化合物3（BAL-0028）进行深入评估，显示出化合物具有良好的理化性质（包含抑制的可逆性、Caco-2渗透性和低CYP抑制潜力等）。SPR检测表明，化合物3直接与NLRP3的NACHT域结合；初步CADD分析表明该化合物具有独特的结合位点，在该蛋白的NACHT结构域与ADP和MCC950有不同的相互作用。通过进一步的化合物优化，获得了具有同等活性但具有更好代谢稳定性的化合物21，这表明该化合物系列具有进一步改善药物特性的潜力。根据BioAge的官网信息，目前NLRP3抑制剂项目处于IND Enabling阶段