近日，南方医科大学南方医院地中海贫血防治创新研究中心联合贝瑞基因在国际血液学顶级期刊Haematologica（IF=11.049）发表了题为An unusual case of thalassemia intermedia with inheritable complex repeats detected by single-molecule optical mapping的论文，南方医科大学博士后张倩倩、硕士生林鹏为本文的共同第一作者，徐湘民教授为通讯作者。
本研究采用了三代HiFi测序结合Bionano光学图谱方法，成功精准诊断一位具有额外24个拷贝的α-珠蛋白基因串联重复复合东南亚型缺失突变(α24 repeatsαα/--SEA)的中间型α-地贫患者，该诊断由贝瑞基因提供技术支持。
先证者为一名3岁半女孩，呈显著小细胞低色素性贫血、血红蛋白组分异常。
血液学检测结果显示，先证者HGB浓度: 87-107 g/L (RI: 110-150g/L)，MCV: 57.8-62.1fL (RI: 82-100fL)，MCH: 18.1-19.0 pg (RI: 27-34 pg)，Hb A2: 1.6-1.9%(RI: 2.5-3.5%)，Hb F: 2.9-10.2%(RI: 2%)。
其血清铁蛋白、白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞和血小板计数均在正常范围内。
Gap-PCR和Sanger测序结果提示先证者一条染色体上存在东南亚型缺失突变--SEA，家系分析表明该缺失遗传自母亲。
MLPA和ddPCR检测到先证者(III-1)、父亲(II-1)和祖母(I-2)的HBA2 区域信号强度显著增强，提示存在高度重复的多联体基因序列。
图1、2. MLPA（上）及ddPCR（下）结果
为更精确地解析这一复杂的突变，研究团队进一步采用了三代SMRT单分子长读长实时测序技术和Bionano光学图谱检测。
最终，通过三代HiFi测序结合Bionano技术，研究团队确定了先证者的α-珠蛋白基因构型：一条染色体存在--SEA缺失，另一条染色体存在24个额外的HBA2 基因重复序列。重复序列单元的长度约为4.2kb，串联重复的总长度约为100kb。先证者的祖母(I-2)和父亲(II-1)均携带该串联重复突变，但他们的血液学指标都正常，这提示额外的HBA2 基因可能是非功能性的且不活跃。进一步的家系血样珠蛋白基因RNA和肽链分析发现HBA2 的串联重复拷贝反过来抑制了正常的α-珠蛋白表达，加重先证者的贫血程度，这可能是由于100kb长片段的插入，导致了远端调控区的超敏位点(HS)与α-珠蛋白基因启动子之间的距离延长，干扰染色质成环效率，影响了HBA1 基因的转录。
图3.三代HiFi检测α-珠蛋白重复序列α24 repeatsαα：read 1:左侧序列及5个完整的anti-4.2重复；read 2：8个完整的anti-4.2重复；read 3：12个完整的anti-4.2重复及右侧序列；read 4:野生型等位基因。
图4. Bionano检测先证者的α-珠蛋白基因型α24 repeatsαα/--SEA
α-珠蛋白基因的重复通常是由于减数分裂过程中，基因簇内的同源片段错位重组导致的，当其单独存在时，对个体血液学参数无显著影响，因此在临床检测中常被忽视。本案例中α24 repeatsαα这一罕见串联重复序列长达100kb，并且在家族三代中保持遗传传递。传统的地贫检测技术，如Gap-PCR，仅能检测已知突变，而MLPA、ddPCR对于未知变异亦只能大致判断确定缺失或重复序列的拷贝数，且不能精准识别α-珠蛋白结构变异的（起始/终止）位点，本案例所报告的α24 repeatsαα基因型为非功能性且不活跃的多拷贝重复，类似假基因干扰，容易造成临床误判，最终导致地贫患儿的出生。三代测序独特的长读长单分子测序技术优势可以为解决临床极端复杂结构变异提供全面、精准的综合解决方案。
南方医科大学徐湘民教授团队长期从事中国人群中α-珠蛋白多联体的流行病学调查，2017年对南方五个省合计20,222名个体进行了研究，结果表明α-珠蛋白三联体的携带率高达1.67%[1]。2020年对广东省六个城市的2,310对夫妇珠蛋白基因型进行详细分析，结果显示广东省α-珠蛋白三联体的携带率为1.99%[2]。
《新英格兰医学杂志》于2021年发表的β-地中海贫血综述[3]中提到，β-地贫变异复合α-珠蛋白多联体（以三联体最为常见）后患者表型会变得更严重，主要是因为α-珠蛋白基因拷贝数增加会加剧α-珠蛋白肽链和β-珠蛋白肽链之间比例的不平衡程度，从而导致了个体出现中重度贫血、皮肤苍黄和肝脾肿大等临床特征。
贝瑞基因三代测序地贫基因检测产品针对复杂结构变异基因型提供了准确的测序，“一步到位”覆盖α-地贫三联体、香港型以及β-地贫重复序列变异等复杂结构变异基因型，更适用于大规模地贫基因筛查，具有显著技术优势。
原文链接
https://doi.org/10.3324/haematol.2023.282902
参考文献
[1] Shang X, Peng Z, Ye Y, et al. Rapid Targeted Next-Generation Sequencing Platform for Molecular Screening and Clinical Genotyping in Subjects with Hemoglobinopathies. EBioMedicine. 2017 Sep;23:150-159.
[2]魏小凤,徐湘民,郭晓玲,等.广东人群中α珠蛋白基因多拷贝频率分布研究[J].实用医学杂志, 2020, 36(10):5.DOI:CNKI:SUN:SYYZ.0.2020-10-024.
[3] Georgalas I, Petrou P, Kanakis M.β-Thalassemias. N Engl J Med. 2021 Jun 3;384(22):2165-2166.